高中生物選必三“基因工程”基礎(chǔ)填空

第三章? ?基因工程

第1節(jié) 重組DNA技術(shù)的基本工具

一、基因工程：

概念：是指在體外通過人工“剪切”和“拼接”等方法，將外源? ? ? ? ??與? ? ? ? ?進(jìn)行組合形成重組DNA，然后導(dǎo)入? ? ? ? ? ? ??，并使其在受體細(xì)胞中表達(dá)，產(chǎn)生人類需要的基因產(chǎn)物的技術(shù)。

操作對象：? ? ? ? ? ? ? ? ??；? ? ? ?操作水平：? ? ? ? ? ? ? ? ??；? ?原理：? ? ? ? ? ? ? ? ??；

操作過程：? ? ??→? ? ??→? ? ??→表達(dá)；

意義：? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?；克服遠(yuǎn)緣雜交不親和障礙

二、重組DNA技術(shù)的基本工具

1、限制性內(nèi)切核酸酶（限制酶）——“分子手術(shù)刀”

1）來源：主要是從? ? ? ? ? ??中分離純化來的

2）作用：能夠識別雙鏈DNA分子的? ? ? ? ? ? ? ? ? ?，并且使每一條鏈中特定部位的? ? ? ? ? ? ?斷開（具有專一性）

3）作用位點：? ? ? ? ? ? ? ? ? ?。

4）作用結(jié)果：產(chǎn)生? ? ? ? ? ?或? ? ? ? ? ? ?（注意：不同的限制酶可能切割形成? ? ? ? ??黏性末端）

2、DNA連接酶——“分子縫合針”

1）作用：將切下來的? ? ? ? ??拼接成新的DNA分子，恢復(fù)兩個脫氧核苷酸之間的? ? ? ? ? ? ? ? ?。

2）種類：E.coli DNA連接酶（只連接___________）和T4 DNA連接酶（縫合___________和? ? ? ? ? ?）

3）比較與DNA相關(guān)的幾種酶

3、基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——“分子運輸車”

1）作用：將? ? ? ? ? ??送入? ? ? ? ? ?，在受體細(xì)胞內(nèi)對目的基因進(jìn)行大量復(fù)制。

2）載體的種類：? ? ? ? ? ? ??（最常用）、? ? ? ? ? ? ? ??或動物病毒

3）載體需具備的條件：

①? ? ? ?存在并能? ? ? ? ? ?或整合到受體DNA上（能使目的基因穩(wěn)定存在且數(shù)量可擴(kuò)增）。

②有? ? ? ? ? ? ?限制酶切割位點（供外源DNA片段（基因）插入其中）

③具有特殊的? ? ? ? ? ?（目的：便于? ? ? ? ? ? ??的篩選）；??

④對受體細(xì)胞? ? ? ? ?、易分離

三、DNA的粗提取與鑒定

1、提取DNA的原理：?

①DNA? ? ? ? ?酒精（體積分?jǐn)?shù)為95%），但某些蛋白質(zhì)? ? ? ??酒精；

②DNA在不同濃度的NaCl溶液中? ? ? ??不同，DNA能溶于? ? ? ? ??的NaCl溶液。

2、鑒定DNA的原理：在一定溫度下（沸水浴），DNA遇? ? ? ? ? ??試劑會呈現(xiàn)? ? ? ?色。

3、試劑作用：酒精：? ? ? ? ? ? ? ? ?；2mol/L 的NaCl溶液：? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ??；

第2節(jié) 基因工程的基本操作程序

基因工程的基本操作程序（主要包括四個步驟）：

目的基因的? ? ? ? ? ? ?→?? ? ? ? ? ? ?的構(gòu)建→?將? ? ? ? ?導(dǎo)入? ? ? ? ?→?目的基因的? ? ? ? ? ??

一、目的基因的篩選與獲取

1、目的基因

1）概念：在基因工程的設(shè)計和操作中，用于改變? ? ? ? ? ? ? ? ?的或獲得預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物的基因。

2）實例：培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因抗蟲棉用到的目的基因是? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ??。

2、篩選合適的目的基因

1）明確目的基因的方法：

①較為有效的方法：從相關(guān)的已知? ? ? ?和? ? ? ?清晰的基因中進(jìn)行篩選。

②技術(shù)手段：? ? ? ? ??技術(shù)、序列數(shù)據(jù)庫、序列比對工具

2）獲取目的基因的方法：①通過構(gòu)建? ? ? ? ? ??來獲取目的基因；②人工合成目的基因

③利用? ? ? ? ??特異性地快速擴(kuò)增目的基因

二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建

1、操作目的：

使目的基因在受體細(xì)胞中? ? ? ? ? ? ? ? ? ??，并且可以遺傳給下一代；

使目的基因能夠在受體細(xì)胞中? ? ? ? ?和? ? ? ??作用。

2、基因表達(dá)載體的組成及其作用：

一個基因表達(dá)載體的組成，除了? ? ? ? ? ?、? ? ? ??外，還必須有? ? ? ? ??、復(fù)制原點等(如圖所示)。

三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞

1、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法 ：

①導(dǎo)入植物細(xì)胞：花粉管通道法、? ? ? ? ? ? ? ? ??；? ?②導(dǎo)入動物細(xì)胞：? ? ? ? ? ? ? ? ??；? ? ??

③導(dǎo)入微生物細(xì)胞：? ? ? ? ? ? ? ? ??（使細(xì)胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)）。

2、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法

該過程經(jīng)過? ? ? ? ?次拼接、? ? ??次導(dǎo)入：

①第一次拼接：將? ? ? ? ?拼接到Ti質(zhì)粒的? ? ? ? ?上

②第二次拼接：農(nóng)桿菌將插入? ? ? ? ? ? ? ? ??拼接到受體細(xì)胞染色體的? ? ? ? ? ??上（非人工操作）

③第一次導(dǎo)入：將含目的基因的? ? ? ? ?重新導(dǎo)入農(nóng)桿菌④第二次導(dǎo)入：農(nóng)桿菌將含? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ??導(dǎo)入? ? ? ? ??（非人工操作）

四、目的基因的檢測與鑒定

1、目的：檢查目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞后，是否穩(wěn)定維持和表達(dá)其? ? ? ? ? ?。

2、分子水平的檢測：

(1)導(dǎo)入水平：? ?①檢測目的：檢測受體細(xì)胞的? ? ? ? ? ? ? ? ? ?上是否插入了? ? ? ? ? ? ? ?。

②技術(shù)手段：? ? ?????等技術(shù)。

(2)轉(zhuǎn)錄水平：? ?①檢測目的：檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了? ? ? ? ? ??。

②技術(shù)手段：? ? ? ? ??等技術(shù)。

(3)翻譯水平：? ?①檢測目的：檢測目的基因是否? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ??。

②技術(shù)手段：? ? ? ? ? ? ? ??技術(shù)。

3、個體水平的鑒定

(1)鑒定目的：檢測個體是否具有? ? ? ? ? ? ? ?。

(2)鑒定方法：? ? ? ? ? ? ? ?（如通過采摘抗蟲棉的葉片飼喂棉鈴蟲）、? ? ? ? ? ? ? ?、活性鑒定等。

（注意：基因工程操作過程中只有第三步“將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞”沒有堿基互補(bǔ)配對現(xiàn)象）

五、利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因

1、PCR的含義（中文名:? ? ? ? ? ? ? ?）：它是一項根據(jù)? ? ? ? ? ? ? ? ?的原理，在體外提供參與? ? ?

的各種組分與反應(yīng)條件，對目的基因的? ? ? ? ? ? ? ? ? ?進(jìn)行大量復(fù)制的技術(shù)。

2、基本條件：? ? ? ? ? ? ??（提供DNA復(fù)制的模板）、? ? ? ? ? ? ?（為DNA聚合酶提供了游離的3'端）、?

（合成子鏈DNA的原料）、? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ??（催化合成DNA子鏈）。

3、PCR反應(yīng)過程：? ? ? ? ???→?? ? ? ? ??→?? ? ? ? ??

①變性：

當(dāng)溫度上升到_______以上時，? ? ? ??斷裂，雙鏈DNA解聚為兩條? ? ? ? ? ? ? ?。

②復(fù)性：

當(dāng)溫度下降到? ? ? ? ? ?時，兩種引物通過? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ??（原則）與兩條單鏈DNA結(jié)合。

③延伸：

當(dāng)溫度上升到? ? ? ? ? ?左右時，溶液中的4種____________在耐高溫的____________的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則合成新的DNA鏈。

4、PCR的結(jié)果：每一次循環(huán)后目的基因的量可以增加一倍。（即成? ? ? ? ??形式擴(kuò)增（約為? ? ? ?，其中n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)））

5、PCR產(chǎn)物的鑒定：常采用? ? ? ? ? ? ? ? ? ?來鑒定PCR的產(chǎn)物。

拓展：PCR技術(shù)與DNA復(fù)制過程比較

探究?實踐：DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定

1、實驗原理

（1）PCR在體外進(jìn)行DNA片段的擴(kuò)增原理：

PCR利用了_________________和________________的原理。

（2）DNA片段電泳鑒定的原理：

①DNA分子具有?可解離的基團(tuán)，在一定的? ? ? ?下，這些基團(tuán)可以帶上? ? ? ??或? ? ? ??，在_________的作用下，這些___________會向著與它所帶電荷_____的電極移動，這個過程就是?電泳。

②在凝膠中DNA分子的遷移速率與___________、_______________和?構(gòu)象等有關(guān)。凝膠中的DNA分子通過?染色，可以在波長為? ? ? ? ? ??的紫外燈下被檢測出來。

2、實驗步驟

（1）DNA片段擴(kuò)增的具體過程：

①移液→ ②? ? ? ?（將微量離心管放入離心機(jī)里，離心約10s，使反應(yīng)液集中在離心管的底部）→③? ? ? ?

（2）PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳鑒定的具體過程：

①制備凝膠：? ? ? ? ??（一般配制質(zhì)量體積比? ? ? ? ??的瓊脂糖溶液）→?? ? ? ??（并插入合適大小的梳子，以形成加樣孔）→? ? ? ? ?（待凝膠溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝膠放入電泳槽內(nèi)）

②進(jìn)行電泳：? ? ? ? ??（電泳緩沖液沒過凝膠1mm為宜）→? ? ? ?（擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物與凝膠載樣緩沖液(內(nèi)含指示劑)混合，緩慢注入凝膠的加樣孔內(nèi)）→? ? ? ? ? ?

③觀察鑒定：（取出凝膠置于? ? ? ?下觀察和照相）

第3節(jié) 基因工程的應(yīng)用

基因工程的應(yīng)用包括有在? ? ? ? ? ?、醫(yī)藥衛(wèi)生、（工業(yè)、環(huán)境、能源）和? ? ? ? ??等方面的應(yīng)用。

一、基因工程在農(nóng)牧業(yè)方面的應(yīng)用

1．在農(nóng)牧業(yè)方面的應(yīng)用有：

用于生產(chǎn)? ? ? ? ? ? ? ? ?植物（如轉(zhuǎn)基因棉花、玉米、大豆和馬鈴薯）；

植物（如：轉(zhuǎn)基因番木瓜和煙草等）；

植物（如：轉(zhuǎn)基因抗除草劑玉米、大豆、油菜和甜菜等）；

改良植物的品質(zhì)（如：提高營養(yǎng)價值與觀賞價值）；

提高? ? ? ? ? ? ? ??（如：生長速率可提高42%-115%的轉(zhuǎn)基因鯉魚）；

改善畜產(chǎn)品的品質(zhì)（如：大降低牛奶中? ? ? ? ??的含量，解決乳糖不耐受問題）；

2．在醫(yī)藥衛(wèi)生方面的應(yīng)用有：

(1)技術(shù)方法

①對微生物或動植物的細(xì)胞進(jìn)行? ?? ? ? ? ?，使它們能夠生產(chǎn)藥物。

②利用乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥物：將? ? ? ? ? ? ??基因與乳腺中特異表達(dá)的基因的? ?? ? ? ? ?等調(diào)控元件重組在一起，通過? ?? ? ??方法導(dǎo)入哺乳動物的受精卵中，培育出的轉(zhuǎn)基因動物通過分泌?? ? ??來?生產(chǎn)所需要的藥物。

③培育移植器官：在器官供體的基因組中導(dǎo)入某種調(diào)節(jié)因子抑制? ?? ? ? ? ?基因的表達(dá)或設(shè)法除去? ?? ? ? ? ?基因，然后再結(jié)合? ?? ? ? ? ?技術(shù)，培育出不會引起? ?? ? ? ? ?反應(yīng)的轉(zhuǎn)基因克隆器官。

(2)實例：重組人干擾素、促紅細(xì)胞生成素、抗凝血酶、血清白蛋白等。

（注意：與乳腺生物反應(yīng)器相比，膀胱生物反應(yīng)器的優(yōu)點是從轉(zhuǎn)基因動物一出生就可以收集產(chǎn)物，不用考慮動物的性別和是否正處于生殖期。膀胱生物反應(yīng)器最顯著的優(yōu)勢在于從尿液中提取蛋白質(zhì)比從乳汁中提取更簡便、高效。）

3．在食品工業(yè)方面的應(yīng)用有：

1）阿斯巴甜是一種普遍使用的甜味劑，主要由? ? ? ? ?和? ? ? ? ??形成，這兩種氨基酸就可以通過基因工程實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)。

2）科學(xué)家將編碼牛凝乳酶的基因?qū)氪竽c桿菌、黑曲霉或酵母菌的基因組中，再通過? ? ? ? ? ?批量生產(chǎn)凝乳酶。

3）通過構(gòu)建? ? ? ? ? ? ??，然后用發(fā)酵技術(shù)大量生產(chǎn)食品工業(yè)用酶。相比從天然產(chǎn)物中提取的酶,用基因工程技術(shù)獲得的工業(yè)用酶的純度更高，而且它的生產(chǎn)成本顯著降低，生產(chǎn)效率較高。

拓展：乳腺生物反應(yīng)器與工程菌生產(chǎn)藥物的區(qū)別

第四節(jié)蛋白質(zhì)工程的原理和應(yīng)用

一、蛋白質(zhì)工程崛起的緣由

1、基因工程的實質(zhì)及不足：

實質(zhì)：將一種生物的? ? ? ??轉(zhuǎn)移到另一種生物體內(nèi)，后者可以產(chǎn)生它本不能產(chǎn)生的? ? ? ??，進(jìn)而表現(xiàn)出? ? ? ??。

不足：基因工程在原則上只能產(chǎn)生自然界中? ? ? ??的蛋白質(zhì)

2、天然蛋白質(zhì)的不足：天然蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能符合? ? ? ??生存的需要，卻不一定完全符合? ? ? ??的需要。

二、蛋白質(zhì)工程的概念分析

（1）基礎(chǔ)：蛋白質(zhì)分子的? ? ? ??及其與? ? ? ?的關(guān)系。

（2）手段：通過? ? ? ??或? ? ? ??，對現(xiàn)有蛋白質(zhì)進(jìn)行改造，或制造一種新的蛋白質(zhì)。

（3）操作對象：? ? ? ? ? ?。（注意：不是直接改造蛋白質(zhì)）

（4）目的：獲得滿足人類的生產(chǎn)和生活需求的? ? ? ??? ??。

三、蛋白質(zhì)工程的基本原理

1、目標(biāo)：根據(jù)人們對蛋白質(zhì)? ? ?的特定需求,對蛋白質(zhì)的? ??行設(shè)計改造。

2、實質(zhì)：改造或合成? ?? ? ?? ?，來定向改造現(xiàn)有蛋白質(zhì)，或制造新的蛋白質(zhì)。

3、基本思路（中心法則的逆推，與天然蛋白質(zhì)合成的過程相反）：

?

?

四、蛋白質(zhì)工程的基本應(yīng)用

1、醫(yī)藥工業(yè)方面

（1）研發(fā)速效胰島素類似物

天然蛋白質(zhì)易形成二聚體或六聚體?→?預(yù)期功能：? ? ? ? ??胰島素的聚合作用→設(shè)計結(jié)構(gòu)：改變B鏈第20～29位氨基酸組成?→?推測序列：B28位脯氨酸替換為____________或?qū)⑺cB29位的____________交換位置→改造形成新胰島素基因?→?轉(zhuǎn)錄形成mRNA?→?翻譯形成多肽鏈?→?折疊形成____________?→?行使功能：有效? ? ? ? ? ?胰島素的聚合。

（2）延長干擾素體外保存時間

天然干擾素不易保存→預(yù)期功能：? ? ? ? ??保存時間?→?設(shè)計結(jié)構(gòu)：氨基酸替換?→?推測序列：一個半胱氨酸變成____________?→?改造形成新干擾素基因?→?轉(zhuǎn)錄形成mRNA?→?翻譯形成多肽鏈?→?折疊形成________

?→?行使功能：在? ? ? ??下可以保存半年。

（3）降低人對小鼠單抗隆抗體的免疫反應(yīng)

通過____________，將小鼠抗體上結(jié)合______的區(qū)域（即可變區(qū)）“嫁接”到人的______（即恒定區(qū)）上，經(jīng)過這樣改造的抗體誘發(fā)免疫反應(yīng)的強(qiáng)度就會______很多。

2、其他工業(yè)方面

蛋白質(zhì)工程被廣泛用于__________________或開發(fā)新的工業(yè)用酶。如枯草桿菌蛋白酶具有水解蛋白質(zhì)的作用，常被用于洗滌劑工業(yè)、絲綢工業(yè)等。迄今為止，利用蛋白質(zhì)工程獲得的該酶的突變體已有上百種，從中可能篩選出一些符合工業(yè)化生產(chǎn)需求的突變體，從而提高這種酶的使用價值。

3、農(nóng)業(yè)方面

（1）______某些參與調(diào)控光合作用的酶，以提高植物光合作用的速率，增加糧食的產(chǎn)量。

（2）利用蛋白質(zhì)工程的思路設(shè)計優(yōu)良微生物農(nóng)藥，通過改造微生物蛋白質(zhì)的? ? ? ? ? ?，使它防治病蟲害的效果? ? ? ? ? ?。

蛋白質(zhì)工程是一項難度很大的工程，主要是因為蛋白質(zhì)發(fā)揮功能必須依賴于正確的____________，而這種_______

_____往往十分復(fù)雜。要設(shè)計出更加符合____________的蛋白質(zhì)，還需要不斷地攻堅克難。隨著科技的深入發(fā)展，蛋白質(zhì)工程將會給人類帶來更多的福祉。

答案：第三章? ?基因工程

第1節(jié) 重組DNA技術(shù)的基本工具

一、基因工程：

概念：是指在體外通過人工“剪切”和“拼接”等方法，將外源?目的基因??與??載體DNA ??進(jìn)行組合形成重組DNA，然后導(dǎo)入??受體細(xì)胞??，并使其在受體細(xì)胞中表達(dá)，產(chǎn)生人類需要的基因產(chǎn)物的技術(shù)。

操作對象：? ?基因? ?；? ? ? ?操作水平：? ?分子水平? ?；? ?原理：??基因重組? ?；

操作過程：?剪切??→?拼接→??導(dǎo)入→表達(dá)；

意義：? ?定向改造生物性狀? ??；克服遠(yuǎn)緣雜交不親和障礙

二、重組DNA技術(shù)的基本工具

1、限制性內(nèi)切核酸酶（限制酶）——“分子手術(shù)刀”

1）來源：主要是從?原核生物??中分離純化來的

2）作用：能夠識別雙鏈DNA分子的??特定核苷酸序列? ?，并且使每一條鏈中特定部位的??磷酸二酯鍵??斷開（具有專一性）

3）作用位點：??磷酸二酯鍵? ?。

4）作用結(jié)果：產(chǎn)生?黏性末端? ??或? ??平末端??（注意：不同的限制酶可能切割形成??相同黏性末端）

2、DNA連接酶——“分子縫合針”

1）作用：將切下來的??DNA片段 ?拼接成新的DNA分子，恢復(fù)兩個脫氧核苷酸之間的??磷酸二酯鍵??。

2）種類：E.coli DNA連接酶（只連接_黏性末端__）和T4 DNA連接酶（縫合_黏性末端__和??平末端??）

3）比較與DNA相關(guān)的幾種酶

3、基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——“分子運輸車”

1）作用：將??外源基因? ?送入??受體細(xì)胞??，在受體細(xì)胞內(nèi)對目的基因進(jìn)行大量復(fù)制。

2）載體的種類：??質(zhì)粒? ??（最常用）、??噬菌體??或動物病毒

3）載體需具備的條件：

①??穩(wěn)定??存在并能?自我復(fù)制??或整合到受體DNA上（能使目的基因穩(wěn)定存在且數(shù)量可擴(kuò)增）。

②有??一個至多個??限制酶切割位點（供外源DNA片段（基因）插入其中）

③具有特殊的?標(biāo)記基因??（目的：便于重組DNA分子 ?的篩選）；??

④對受體細(xì)胞?無害??、易分離

三、DNA的粗提取與鑒定

1、提取DNA的原理：?

①DNA?不溶于??酒精（體積分?jǐn)?shù)為95%），但某些蛋白質(zhì)??溶于??酒精；

②DNA在不同濃度的NaCl溶液中?溶解度??不同，DNA能溶于??2mol/L?的NaCl溶液。

2、鑒定DNA的原理：在一定溫度下（沸水浴），DNA遇??二苯胺? ?試劑會呈現(xiàn)??藍(lán)??色。

3、試劑作用：酒精：??析出DNA ??；2mol/L 的NaCl溶液：? ? ?溶解DNA ??；

第2節(jié) 基因工程的基本操作程序

基因工程的基本操作程序（主要包括四個步驟）：

目的基因的??篩選與獲取?→???基因表達(dá)載體的構(gòu)建→?將?目的基因導(dǎo)入??受體細(xì)胞→?目的基因的?檢測與鑒定

一、目的基因的篩選與獲取

1、目的基因

1）概念：在基因工程的設(shè)計和操作中，用于改變??受體細(xì)胞性狀??的或獲得預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物的基因。

2）實例：培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因抗蟲棉用到的目的基因是??Bt抗蟲蛋白基因 ?。

2、篩選合適的目的基因

1）明確目的基因的方法：

①較為有效的方法：從相關(guān)的已知??結(jié)構(gòu)? ?和??功能? ?清晰的基因中進(jìn)行篩選。

②技術(shù)手段：? ?測序技術(shù)、序列數(shù)據(jù)庫、序列比對工具

2）獲取目的基因的方法：①通過構(gòu)建??基因文庫??來獲取目的基因；②人工合成目的基因

③利用??PCR ?特異性地快速擴(kuò)增目的基因

3、利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因

1）PCR的含義（中文名:?聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）：它是一項根據(jù)?DNA半保留復(fù)制?的原理，在體外提供參與??DNA復(fù)制 ?的各種組分與反應(yīng)條件，對目的基因的??核苷酸序列??進(jìn)行大量復(fù)制的技術(shù)。

2）基本條件：? ?DNA模板?（提供DNA復(fù)制的模板）、??2種引物 ??（為DNA聚合酶提供了游離的3'端）、?

四種脫氧核苷酸? ?（合成子鏈DNA的原料）、? ?Taq DNA聚合酶 ??（催化合成DNA子鏈）。

3）PCR反應(yīng)過程：??變性???→???復(fù)性???→???延伸??

①變性：

當(dāng)溫度上升到__90℃_以上時，?氫鍵斷裂，雙鏈DNA解聚為兩條??單鏈DNA ?。

②復(fù)性：

當(dāng)溫度下降到? ?50℃ ?時，兩種引物通過??堿基互補(bǔ)配對（原則）與兩條單鏈DNA結(jié)合。

③延伸：

當(dāng)溫度上升到??72℃ ?左右時，溶液中的4種___脫氧核苷酸___在耐高溫的__?DNA聚合酶_的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則合成新的DNA鏈。

4）PCR的結(jié)果：每一次循環(huán)后目的基因的量可以增加一倍。（即成?指數(shù)??形式擴(kuò)增（約為?2n?，其中n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）

5）PCR產(chǎn)物的鑒定：常采用??瓊脂糖凝膠電泳??來鑒定PCR的產(chǎn)物。

拓展：PCR技術(shù)與DNA復(fù)制過程比較

二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建

1、操作目的：

使目的基因在受體細(xì)胞中??穩(wěn)定遺傳? ??，并且可以遺傳給下一代；

使目的基因能夠在受體細(xì)胞中? ?表達(dá)?和?發(fā)揮??作用。

2、基因表達(dá)載體的組成及其作用：

一個基因表達(dá)載體的組成，除了??啟動子?、?終止子?外，還必須有?標(biāo)記基因??、復(fù)制原點等(如圖所示)。

?

三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞

1、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法 ：

①導(dǎo)入植物細(xì)胞：花粉管通道法、?農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法? ?；? ?②導(dǎo)入動物細(xì)胞：??顯微注射法? ?；? ? ??

③導(dǎo)入微生物細(xì)胞：? ??Ca2+處理法?（使細(xì)胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)）。

2、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法

該過程經(jīng)過??兩次拼接、?兩次導(dǎo)入：

①第一次拼接：將?目的基因??拼接到Ti質(zhì)粒的?T-DNA上

②第二次拼接：農(nóng)桿菌將插入?目的基因的T-DNA?拼接到受體細(xì)胞染色體的??DNA上 ?上（非人工操作）

③第一次導(dǎo)入：將含目的基因的??Ti質(zhì)粒?重新導(dǎo)入農(nóng)桿菌④第二次導(dǎo)入：農(nóng)桿菌將含? ??目的基因的T-DNA ??導(dǎo)入

受體細(xì)胞（非人工操作）

四、目的基因的檢測與鑒定

1、目的：檢查目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞后，是否穩(wěn)定維持和表達(dá)其? ?遺傳特性? ?。

2、分子水平的檢測：

(1)導(dǎo)入水平：? ?①檢測目的：檢測受體細(xì)胞的??染色體的DNA ?上是否插入了??目的基因? ?。

②技術(shù)手段：?PCR??等技術(shù)。

(2)轉(zhuǎn)錄水平：? ?①檢測目的：檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了??mRNA ?。

②技術(shù)手段：??PCR?等技術(shù)。

(3)翻譯水平：? ?①檢測目的：檢測目的基因是否? ?翻譯成蛋白質(zhì)? ?。

②技術(shù)手段：? ?抗原-抗體雜交檢測 ??技術(shù)。

3、個體水平的鑒定

(1)鑒定目的：檢測個體是否具有??相應(yīng)性狀? ?。

(2)鑒定方法：? ?抗蟲鑒定??（如通過采摘抗蟲棉的葉片飼喂棉鈴蟲）、??抗病鑒定??、活性鑒定等。

（注意：基因工程操作過程中只有第三步“將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞”沒有堿基互補(bǔ)配對現(xiàn)象）

探究?實踐：DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定

1、實驗原理

（1）PCR在體外進(jìn)行DNA片段的擴(kuò)增原理：

PCR利用了__DNA的熱變性原理___和___DNA半保留復(fù)制__的原理。

（2）DNA片段電泳鑒定的原理：

①DNA分子具有?可解離的基團(tuán)，在一定的?pH ?下，這些基團(tuán)可以帶上?正電荷??或?負(fù)電荷??，在_電場_的作用下，這些__帶電分子__會向著與它所帶電荷_相反_的電極移動，這個過程就是?電泳。

②在凝膠中DNA分子的遷移速率與__凝膠的濃度__、_DNA分子的大小_和?構(gòu)象等有關(guān)。凝膠中的DNA分子通過?染色，可以在波長為??300nm ?的紫外燈下被檢測出來。

2、實驗步驟

（1）DNA片段擴(kuò)增的具體過程：

①移液→ ②?離心（將微量離心管放入離心機(jī)里，離心約10s，使反應(yīng)液集中在離心管的底部）→③??反應(yīng)??

（2）PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳鑒定的具體過程：

①制備凝膠：??融化（一般配制質(zhì)量體積比??0.8%～1.2% ?的瓊脂糖溶液）→???倒模??（并插入合適大小的梳子，以形成加樣孔）→? ?凝固??（待凝膠溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝膠放入電泳槽內(nèi)）

②進(jìn)行電泳：??加液??（電泳緩沖液沒過凝膠1mm為宜）→??加樣??（擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物與凝膠載樣緩沖液(內(nèi)含指示劑)混合，緩慢注入凝膠的加樣孔內(nèi)）→? ?電泳? ?

③觀察鑒定：（取出凝膠置于??紫外燈下觀察和照相）

第3節(jié) 基因工程的應(yīng)用

基因工程的應(yīng)用包括有在??農(nóng)牧業(yè)??、醫(yī)藥衛(wèi)生、（工業(yè)、環(huán)境、能源）和??食品工業(yè)??等方面的應(yīng)用。

一、基因工程在農(nóng)牧業(yè)方面的應(yīng)用

1．在農(nóng)牧業(yè)方面的應(yīng)用有：

用于生產(chǎn)? ??轉(zhuǎn)基因抗蟲??植物（如轉(zhuǎn)基因棉花、玉米、大豆和馬鈴薯）；

轉(zhuǎn)基因抗病? ?植物（如：轉(zhuǎn)基因番木瓜和煙草等）；

轉(zhuǎn)基因抗除草劑??植物（如：轉(zhuǎn)基因抗除草劑玉米、大豆、油菜和甜菜等）；

改良植物的品質(zhì)（如：提高營養(yǎng)價值與觀賞價值）；

提高??動物的生長速率? ?（如：生長速率可提高42%-115%的轉(zhuǎn)基因鯉魚）；

改善畜產(chǎn)品的品質(zhì)（如：大降低牛奶中??乳糖?的含量，解決乳糖不耐受問題）；

2．在醫(yī)藥衛(wèi)生方面的應(yīng)用有：

(1)技術(shù)方法

①對微生物或動植物的細(xì)胞進(jìn)行基因改造??，使它們能夠生產(chǎn)藥物。

②利用乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥物：將??藥用蛋白基因??基因與乳腺中特異表達(dá)的基因的??啟動子??等調(diào)控元件重組在一起，通過顯微注射?方法導(dǎo)入哺乳動物的受精卵中，培育出的轉(zhuǎn)基因動物通過分泌?乳汁??來?生產(chǎn)所需要的藥物。

③培育移植器官：在器官供體的基因組中導(dǎo)入某種調(diào)節(jié)因子抑制??抗原決定??基因的表達(dá)或設(shè)法除去抗原決定基因，然后再結(jié)合克隆?技術(shù)，培育出不會引起免疫排斥??反應(yīng)的轉(zhuǎn)基因克隆器官。

(2)實例：重組人干擾素、促紅細(xì)胞生成素、抗凝血酶、血清白蛋白等。

（注意：與乳腺生物反應(yīng)器相比，膀胱生物反應(yīng)器的優(yōu)點是從轉(zhuǎn)基因動物一出生就可以收集產(chǎn)物，不用考慮動物的性別和是否正處于生殖期。膀胱生物反應(yīng)器最顯著的優(yōu)勢在于從尿液中提取蛋白質(zhì)比從乳汁中提取更簡便、高效。）

3．在食品工業(yè)方面的應(yīng)用有：

1）阿斯巴甜是一種普遍使用的甜味劑，主要由??天冬氨酸和??苯丙氨酸形成，這兩種氨基酸就可以通過基因工程實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)。

2）科學(xué)家將編碼牛凝乳酶的基因?qū)氪竽c桿菌、黑曲霉或酵母菌的基因組中，再通過??工業(yè)發(fā)酵??批量生產(chǎn)凝乳酶。

3）通過構(gòu)建??基因工程菌? ?，然后用發(fā)酵技術(shù)大量生產(chǎn)食品工業(yè)用酶。相比從天然產(chǎn)物中提取的酶,用基因工程技術(shù)獲得的工業(yè)用酶的純度更高，而且它的生產(chǎn)成本顯著降低，生產(chǎn)效率較高。

拓展：乳腺生物反應(yīng)器與工程菌生產(chǎn)藥物的區(qū)別

第四節(jié)蛋白質(zhì)工程的原理和應(yīng)用

一、蛋白質(zhì)工程崛起的緣由

1、基因工程的實質(zhì)及不足：

實質(zhì)：將一種生物的??基因?轉(zhuǎn)移到另一種生物體內(nèi)，后者可以產(chǎn)生它本不能產(chǎn)生的?蛋白質(zhì)??，進(jìn)而表現(xiàn)出?新性狀?。

不足：基因工程在原則上只能產(chǎn)生自然界中??已存在?的蛋白質(zhì)

2、天然蛋白質(zhì)的不足：天然蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能符合??特定物種?生存的需要，卻不一定完全符合?人類生產(chǎn)和生活?的需要。

二、蛋白質(zhì)工程的概念分析

（1）基礎(chǔ)：蛋白質(zhì)分子的?結(jié)構(gòu)規(guī)律??及其與?生物功能??的關(guān)系。

（2）手段：通過?改造?或??合成基因?，對現(xiàn)有蛋白質(zhì)進(jìn)行改造，或制造一種新的蛋白質(zhì)。

（3）操作對象：?基因??。（注意：不是直接改造蛋白質(zhì)）

（4）目的：獲得滿足人類的生產(chǎn)和生活需求的??蛋白質(zhì)??。

三、蛋白質(zhì)工程的基本原理

1、目標(biāo)：根據(jù)人們對蛋白質(zhì)?功能?的特定需求，對蛋白質(zhì)的??結(jié)構(gòu)??行設(shè)計改造。

2、實質(zhì)：改造或合成??基因? ?，來定向改造現(xiàn)有蛋白質(zhì)，或制造新的蛋白質(zhì)。

3、基本思路（中心法則的逆推，與天然蛋白質(zhì)合成的過程相反）：

?

?

四、蛋白質(zhì)工程的基本應(yīng)用

1、醫(yī)藥工業(yè)方面

（1）研發(fā)速效胰島素類似物

天然蛋白質(zhì)易形成二聚體或六聚體?→?預(yù)期功能：??抑制胰島素的聚合作用→設(shè)計結(jié)構(gòu)：改變B鏈第20～29位氨基酸組成?→?推測序列：B28位脯氨酸替換為__天冬氨酸__或?qū)⑺cB29位的_賴氨酸_交換位置→改造形成新胰島素基因?→?轉(zhuǎn)錄形成mRNA?→?翻譯形成多肽鏈?→?折疊形成___蛋白質(zhì)（預(yù)期結(jié)構(gòu)）___?→?行使功能：有效??抑制? ?胰島素的聚合。

（2）延長干擾素體外保存時間

天然干擾素不易保存→預(yù)期功能：?延長??保存時間?→?設(shè)計結(jié)構(gòu)：氨基酸替換?→?推測序列：一個半胱氨酸變成__絲氨酸___?→?改造形成新干擾素基因?→?轉(zhuǎn)錄形成mRNA?→?翻譯形成多肽鏈?→?折疊形成_蛋白質(zhì)（預(yù)期結(jié)構(gòu)）_?→?行使功能：在??-70℃?下可以保存半年。

（3）降低人對小鼠單抗隆抗體的免疫反應(yīng)

通過__改造基因__，將小鼠抗體上結(jié)合__抗原_的區(qū)域（即可變區(qū)）“嫁接”到人的__抗體__（即恒定區(qū)）上，經(jīng)過這樣改造的抗體誘發(fā)免疫反應(yīng)的強(qiáng)度就會_減低_很多。

2、其他工業(yè)方面

蛋白質(zhì)工程被廣泛用于__改進(jìn)酶___或開發(fā)新的工業(yè)用酶。如枯草桿菌蛋白酶具有水解蛋白質(zhì)的作用，常被用于洗滌劑工業(yè)、絲綢工業(yè)等。迄今為止，利用蛋白質(zhì)工程獲得的該酶的突變體已有上百種，從中可能篩選出一些符合工業(yè)化生產(chǎn)需求的突變體，從而提高這種酶的使用價值。

3、農(nóng)業(yè)方面

（1）_改造__某些參與調(diào)控光合作用的酶，以提高植物光合作用的速率，增加糧食的產(chǎn)量。

（2）利用蛋白質(zhì)工程的思路設(shè)計優(yōu)良微生物農(nóng)藥，通過改造微生物蛋白質(zhì)的??結(jié)構(gòu)??，使它防治病蟲害的效果? ?增強(qiáng)? ?。

蛋白質(zhì)工程是一項難度很大的工程，主要是因為蛋白質(zhì)發(fā)揮功能必須依賴于正確的_高級結(jié)構(gòu)__，而這種___高級結(jié)構(gòu)____往往十分復(fù)雜。要設(shè)計出更加符合__人類需求_的蛋白質(zhì)，還需要不斷地攻堅克難。隨著科技的深入發(fā)展，蛋白質(zhì)工程將會給人類帶來更多的福祉。

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